Naťahovacia DNA a bielenie buniek

Utorok sme začali pri bakteriálnych bunkách, ktoré sme si "naočkovali" špeciálnou sekvenciou DNA vo štvrtok. Z baktérií sme potrebovali dostať DNA, ktorá sa dá na oplátku naočkovať do iných baktérií, ktoré sú lepšie uspôsobené na tvorbu proteínov podľa tejto DNA.
Celá procedúra sa volá Mini Prep, pretože sme pripravovali iba veľmi malé množstvo DNA, ktorú by sme mohli poslať na sekvenovanie a tak zistiť, či sa nám podarilo do baktérií dostať DNA, ktorú sme tam chceli vložiť.
Začali sme tým, že sme baktérie zcentrifugovali a potom rozmiešali v špeciálnej zmesi chemikálií, ktorá rozbije stenu bakteriálnych buniek a uvoľní DNA. To, že sa tak stalo, sa pekne ukáže v skúmavke tým, že vyzerá ako zrazená masa, a keď ju otvoríte, vlákna DNA sú ako lepidlo a prilepili sa na viečko a natiahli sa ako syr z pizze :D. Tohto efektu sa zbavíme tak, že pridáme látku, ktorá zrazí všetky bunečné komponenty okrem DNA a dáme to do centrifúgy. Tento krát si ponecháme supernatant, teda tekutú súčasť skúmavky po centrufugácii, kde je rozpustená DNA. Supernatant znova stočíme v centrifúge, vylejeme nový supernatant a DNA , ktorá zostala na dne skúmavky rozpustíme vo vode a zmeriame koncentráciu na veľmi cool prístroji, ktorý potrebuje iba malilinkú kvapku (niekoľko mikrolitrov) zmesi aby určil presnú koncentráciu roztoku.
Keď máme vzorku pripravenú, prichádza na rad trochu byrokracie, a to objednanie sekvenovania DNA. Ku každej vzorke treba vypísať niekoľko parametrov, vytlačiť faktpru a odniesť vzorky do skladu, kde si ich firma, ktorá sekvenuje DNA vyzdvihne a na ďalší deň máme výsledky.

Naša hlavná úloha dnes bola experiment s žabacími embryami, ktorý sa minulý týždeň nevydaril, lebo embryá umreli. Tentokrát sme začali s novými žabacími vajíčkami plní nádeje. Už tie samotné vyzerali zdravšie ako posledný krát. Ku vajíčkam sme primiešali kúsok semenníka a dali im čas na oplodnenie. Potom nasledovalo odstránenie želatínovej vrstvy na vajíčkach v zmesi chemikálií. Oplodnené vajíčka - embryá sme potom nechali pri nízkej teplote (aby sme spomalili rast) chvíľu rásť aby sa dostali do fázy kde sa jedna bunka rozdelila na dve. Potrebovali sme 2 bunky aby sme mohli každú z nich nainjektovať rôznymi látkami. Embryá sme očkovali špecifickou protilátkou. Protilátka je proteín, ktorý ma veľmi špecifický tvar ktorý sa viaže na inú chemikáliu ktorá má kompatibilný tvar. Naša protilátka mohla potencionálne ovplyvniť tvorbu filopódií - výbežkov z membrány. Aby sme vedeli rozlíšiť, do ktorej bunky protilátka išla a do ktorej nie, obidve bunky sa museli naočkovať zelenou farbičkou ktorá sa viaže na membránu a umožní nám vidieť bunky a bunku do ktorej očkujeme protilátku naočkovať aj červenou farbou aby sme ju vedeli odlíšiť.
     Nemusím ani hovoriť, že to bol nesmierne piplavý proces - používa sa naň veľmi tenká sklenená trubička, ktorá sa ovláda akýmsi joystickom a "vystrelí" do bunky presné množstvo látky, ktorú do nej vložíme. Bunky bez ochranného obalu boli veľmi krehké a bolo ich treba očkovať na presné miesto. Toto povedané, tento proces som s radosťou prenechala pani laborantke keďže pri mojich chabých pokusoch sa mi podarilo zabiť viac než pár nevinných embryí. Nainjektované 

embryá sa začali rýchlo ďalej deliť a čoskoro sme uvideli 4-bunkovú aj 8-bunkovú fázu. Do najbližšieho dňa sme ich nechali ďalej rásť pri nízkej teplote.

Takýto detský "mikroskop" mali v labáku a použila som ho na fotenie buniek.

Ďalšia vec, pri ktorej som v utorok pomáhala bola príprava čistého proteínu. Proteíny sa používajú v zmesi viacerých proteínov, ktoré odštartujú na membráne rast filopódií.
Celá procedúra sa musí robiť v "studenej miestnosti", kde sú 4 stupne Celzia - nízka teplota je potrebná na to aby sa proteíny nezdeformovali vďaka teplu. Takže sme si obliekli pre istotu dve laboratórne plášte a išli sme na to. Potrebovali sme bunky, ktoré boli už predtým pozmenené tak, aby vyrábali veľa práve nášho proteínu. Tieto bunky sme "rozbili" v sonikátore - mašinke, ktorá vyvíja vibrácie, ktoré narušia bunku. Taktiež ale môžu narušiť naše ušné bubienky a tak sme si museli nasadiťslúchatká. Sonikátor vyzerá ako veľká kovová trubka, na ktorú sa nabodne skúmavka.
Ďalším krokom je zas a len centrufugácia. Ako si už dokážete predstaviť, centrifúgy sú tu úplne všade. od malých na stole, ktoré pustíte na pár minút až po obrovské obludy, ktoré točia vzorky vo vákuu, lebo by sa inak mohli rozhorúčiť až tak, že by vzbĺki. My sme zamierili práve k jednej z nich. Naš vzorky sa točili asi 40 minút pri 4 stupňoch a úplnom vákuu.
Skúmavky, ktoré sme potom vytiahli, mali na dne bunečné komponenty, organely, membrány a iné pevné časti bunky a v supernatante sa nachádzal rozpustený náš proteín.
Supernatant sme odliali ale teraz sme potrebovali z tisícok rôznych proteínov v ňom vybrať ten náš. Na to sa používajú malinké guľôčky z želatínovéj látky, ktoré sú "obalené" protilátkami na ktoré sa prilepil iba náš proteín a guličky sme potom jednoducho odfiltrovali. S pomocou zopár chemikálii potm už len treba náš proteín z guličiek "odlepiť" a vzorka je hotová. To, či je vzorka správna, sme otestovali v elektroforéze, trochu odlišnej od tej na DNA.

Posledná vec, ktorú som v utorok v laboratóriu videla bola mikroskopovanie membrán. Hanae pracovala so špecifickým proteínom, ktorý pomáha pri tvorbe filopódií. Pod mikroskopom ho bolo vidno, lebo bol označený fluorescenčnou farbičkou a tak sa ako jediný ukázal pod správnym nastavením farby svetla. Hanae, chcela sledovať či je tento proteín dynamický a často sa v membráne premiestňuje alebo naopak nie. Na toto sa dá využiť veľmi zaujímavá technika, ktorá sa volá frapping. Dalo by sa povedať, že je to spôsob ako odfarbiť časť vzorky pomocou lasera. Časť proteínu ktorú sami vyberieme akoby stratí farbu. Ak sa táto farba postupne nahradí na tom istom mieste, znači to, že sa proteín premiestňuje a bezfarebné proteíny boli nahradené farebnými.

V membráne existujú "ostovčeky" ktoré sú z iných molekúl ako zvyšok - dokázu vymieňať molekuly v ostovčeku ale ak ho vybielime celý, nemajú ich aké nahradiť.